小鼠原代肝細胞分離提取技術(shù)步驟

小鼠原代肝細胞分離提取技術(shù)的成功實施，關(guān)鍵在于后續(xù)的細胞培養(yǎng)與功能維持環(huán)節(jié)。在完成肝臟灌注消化后，需立即將細胞懸液置于預冷的完全培養(yǎng)基中，以4℃低溫離心（50-100g，3分鐘）去除非實質(zhì)細胞碎片。此時采用90%高糖DMEM配合10%胎牛血清的雙抗培養(yǎng)基，可顯著提高細胞貼壁率。

小鼠原代肝細胞分離提取是肝臟相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)技術(shù)，其關(guān)鍵在于保證細胞活性和功能完整性。以下為技術(shù)流程的后續(xù)關(guān)鍵步驟及注意事項：

?梯度離心純化
將消化后的細胞懸液經(jīng)70μm濾網(wǎng)過濾后，采用25%-50%的Percoll密度梯度離心（800g，10分鐘，4℃），可有效去除紅細胞和細胞碎片。離心后可見明顯分層，肝細胞主要分布于中層乳白色環(huán)帶，用巴氏管小心吸取目標層細胞，以預冷的PBS洗滌2次。此步驟需嚴格控制離心速度，過度離心會導致細胞膜損傷。

臺盼藍活性檢測
將重懸的細胞與0.4%臺盼藍溶液按1:1混合，3分鐘內(nèi)用血球計數(shù)板計數(shù)。優(yōu)質(zhì)制備的肝細胞存活率應＞85%，若低于此值，需檢查膠原酶批號有效性或縮短消化時間。值得注意的是，冬季操作時應將染液預熱至37℃，避免溫度驟變影響染色效果。

差速貼壁純化
將細胞接種于經(jīng)0.1%明膠預處理的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)30分鐘后，未貼壁的肝細胞可被輕輕吹打收集。此方法能有效去除庫普弗細胞等雜質(zhì)，但需嚴格控制時間，過久貼壁會導致肝細胞活性下降。建議使用含10%FBS的Williams E培養(yǎng)基維持細胞功能。

凍存與復蘇要點
采用分階段降溫法：4℃平衡30分鐘→-20℃2小時→液氮氣相過夜后浸入。復蘇時需快速37℃水浴震蕩，離心后建議使用含5mM NAC的培養(yǎng)基，可顯著降低氧化應激損傷。實驗顯示經(jīng)凍存的肝細胞在3小時內(nèi)完成接種時，其白蛋白分泌能力可保持新鮮細胞的82%±6%。

該技術(shù)需特別注意膠原酶IV的活性驗證，建議每批次進行小樣測試。操作全程保持低溫環(huán)境（除消化步驟外），使用經(jīng)肝素處理的器械可有效防止細胞聚團。成功的原代肝細胞培養(yǎng)在倒置顯微鏡下應呈現(xiàn)典型的多邊形形態(tài)，48小時內(nèi)可見清晰的膽小管網(wǎng)絡形成。

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為獲得高純度肝細胞，可采用percoll密度梯度離心法（25%-50%梯度），該方法能有效分離紅細胞和庫普弗細胞。值得注意的是，新鮮分離的肝細胞在培養(yǎng)6小時后會出現(xiàn)首次凋亡高峰，建議在培養(yǎng)皿表面預先包被Ⅰ型膠原（0.1mg/cm2），通過模擬細胞外基質(zhì)環(huán)境延緩去分化進程。

在功能驗證階段，建議采用吲哚菁綠（ICG）攝取實驗評估細胞代謝活性，功能性肝細胞會在培養(yǎng)24小時內(nèi)特異性攝取并分解該染料。同時，尿素合成速率（每106細胞每日≥20μg）和albumin分泌量（＞5μg/mL/24h）是評價細胞質(zhì)量的核心指標。對于需要長期培養(yǎng)的實驗，可嘗試添加10mM煙酰胺和0.1μM地塞米松，這兩種成分能協(xié)同維持CYP450酶系的表達水平。