小鼠原代肝細(xì)胞分離提取技術(shù)步驟

小鼠原代肝細(xì)胞分離提取技術(shù)的成功實(shí)施，關(guān)鍵在于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)與功能維持環(huán)節(jié)。在完成肝臟灌注消化后，需立即將細(xì)胞懸液置于預(yù)冷的完全培養(yǎng)基中，以4℃低溫離心（50-100g，3分鐘）去除非實(shí)質(zhì)細(xì)胞碎片。此時采用90%高糖DMEM配合10%胎牛血清的雙抗培養(yǎng)基，可顯著提高細(xì)胞貼壁率。

小鼠原代肝細(xì)胞分離提取是肝臟相關(guān)研究的重要基礎(chǔ)技術(shù)，其關(guān)鍵在于保證細(xì)胞活性和功能完整性。以下為技術(shù)流程的后續(xù)關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)：

?梯度離心純化
將消化后的細(xì)胞懸液經(jīng)70μm濾網(wǎng)過濾后，采用25%-50%的Percoll密度梯度離心（800g，10分鐘，4℃），可有效去除紅細(xì)胞和細(xì)胞碎片。離心后可見明顯分層，肝細(xì)胞主要分布于中層乳白色環(huán)帶，用巴氏管小心吸取目標(biāo)層細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌2次。此步驟需嚴(yán)格控制離心速度，過度離心會導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷。

臺盼藍(lán)活性檢測
將重懸的細(xì)胞與0.4%臺盼藍(lán)溶液按1:1混合，3分鐘內(nèi)用血球計數(shù)板計數(shù)。優(yōu)質(zhì)制備的肝細(xì)胞存活率應(yīng)＞85%，若低于此值，需檢查膠原酶批號有效性或縮短消化時間。值得注意的是，冬季操作時應(yīng)將染液預(yù)熱至37℃，避免溫度驟變影響染色效果。

差速貼壁純化
將細(xì)胞接種于經(jīng)0.1%明膠預(yù)處理的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)30分鐘后，未貼壁的肝細(xì)胞可被輕輕吹打收集。此方法能有效去除庫普弗細(xì)胞等雜質(zhì)，但需嚴(yán)格控制時間，過久貼壁會導(dǎo)致肝細(xì)胞活性下降。建議使用含10%FBS的Williams E培養(yǎng)基維持細(xì)胞功能。

凍存與復(fù)蘇要點(diǎn)
采用分階段降溫法：4℃平衡30分鐘→-20℃2小時→液氮?dú)庀噙^夜后浸入。復(fù)蘇時需快速37℃水浴震蕩，離心后建議使用含5mM NAC的培養(yǎng)基，可顯著降低氧化應(yīng)激損傷。實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)凍存的肝細(xì)胞在3小時內(nèi)完成接種時，其白蛋白分泌能力可保持新鮮細(xì)胞的82%±6%。

該技術(shù)需特別注意膠原酶IV的活性驗(yàn)證，建議每批次進(jìn)行小樣測試。操作全程保持低溫環(huán)境（除消化步驟外），使用經(jīng)肝素處理的器械可有效防止細(xì)胞聚團(tuán)。成功的原代肝細(xì)胞培養(yǎng)在倒置顯微鏡下應(yīng)呈現(xiàn)典型的多邊形形態(tài)，48小時內(nèi)可見清晰的膽小管網(wǎng)絡(luò)形成。

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為獲得高純度肝細(xì)胞，可采用percoll密度梯度離心法（25%-50%梯度），該方法能有效分離紅細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞。值得注意的是，新鮮分離的肝細(xì)胞在培養(yǎng)6小時后會出現(xiàn)首次凋亡高峰，建議在培養(yǎng)皿表面預(yù)先包被Ⅰ型膠原（0.1mg/cm2），通過模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境延緩去分化進(jìn)程。

在功能驗(yàn)證階段，建議采用吲哚菁綠（ICG）攝取實(shí)驗(yàn)評估細(xì)胞代謝活性，功能性肝細(xì)胞會在培養(yǎng)24小時內(nèi)特異性攝取并分解該染料。同時，尿素合成速率（每106細(xì)胞每日≥20μg）和albumin分泌量（＞5μg/mL/24h）是評價細(xì)胞質(zhì)量的核心指標(biāo)。對于需要長期培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)，可嘗試添加10mM煙酰胺和0.1μM地塞米松，這兩種成分能協(xié)同維持CYP450酶系的表達(dá)水平。